ЭВОЛЮЦИЯ РНК В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ
Таким образом, с одной стороны, молекулярные колонии нам помогли найти источник так называемого спонтанного синтеза РНК, а, с другой стороны, они подвергли сомнению эксперименты Сола Шпигельмана (Sol Spiegelman), которые были проведены сразу после того, как Qβ-репликаза была обнаружена, и которые до сих пор цитируются как эксперименты, в которых впервые была показана эволюция молекул в пробирке (Joyce, 2007).
Что было сделано Шпигельманом? Он брал в качестве исходной матрицы геномную РНК фага Qβ. Это длинная одноцепочечная РНК: более 4000 нуклеотидов. Добавлял сколько-то этой матрицы в пробирку с репликазой и нуклеотидами. Через некоторое время маленькую порцию переносил в следующую пробирку, потом в следующую, следующую, следующую… Таким образом, осуществлял последовательные пересевы. И оказалось, что если сделать 20-30 пересевов и проанализировать продукты синтеза, то в продуктах обнаруживается не высокомолекулярная РНК — та, исходная, 4000 нуклеотидов длиной, — а малые РНК, длиной около 200-300 нуклеотидов (Chetverin, 1997). Шпигельман и соавторы сделали вывод о том, что в их экспериментах путем спонтанных делеций происходили изменения РНК в направлении увеличения скорости репликации. И таким образом они имели, буквально, эволюцию в пробирке: у них из неэффективно реплицирующейся большой молекулы получились эффективно реплицирующиеся малые молекулы РНК.
Рис. 5. Отбор рекомбинантных молекул РНК по способности реплицироваться.
Однако в свете наших результатов о том, что так называемый спонтанный синтез вызывается загрязнениями РНК, присутствующими в воздухе, можно предположить, что в вышеуказанных экспериментах происходила не эволюция, а просто вытеснение одних малоэффективно реплицируемых молекул другими более эффективно реплицируемыми молекулами.
Все-таки, возможно ли создание новой генетической информации на уровне РНК? Мы попытались ответить на этот вопрос с помощью молекулярных колоний. С этой целью использовали два взаимодополняющих фрагмента реплицируемой РНК: 5′-фрагмент (то есть, 5′-концевой фрагмент) и З’-фрагмент. Qβ-репликаза может экспоненциально размножать целую молекулу РНК, но не может размножать ее составные фрагменты. Однако если между фрагментами произойдет реакция (ее называют рекомбинацией) таким образом, что образуется целая молекула, включающая оба фрагмента, то тогда, возможно, образуется реплицируемая молекула (рис. 5). Действительно, так и оказалось. Мы приготовили смесь фрагментов, посеяли ее на агарозу с репликазой, потом накрыли эту агарозу мембраной, пропитанной нуклеотидами — субстратами для синтеза РНК. Если только один фрагмент присутствовал в агарозе, то никаких колоний РНК мы не видели. Но если в агарозе присутствовали оба фрагмента, то колонии образовывались. Отсюда мы сделали вывод о том, что, действительно, между фрагментами происходит реакция таким образом, что из двух молекул получается одна, то есть образуется новый РНК-геном (Chetverin, 1997).
В вышеописанном эксперименте в реакции, в агарозе, присутствовала Qβ-репликаза. Поэтому было непонятно, кто осуществляет рекомбинацию? Сами по себе фрагменты реагируют друг с другом или Qβ-репликаза каким-то образом их соединяет? Мы несколько изменили постановку эксперимента. Оказалось, что если фрагменты окислить: обработать их перйодатом натрия таким образом, что будут уничтожены З’-гидроксилы, — то тогда Qβ-репликаза не способна промотировать рекомбинацию между такими фрагментами. Мы инкубировали смесь фрагментов в присутствии ионов Mg2+ без Qβ-репликазы, после чего окисляли реакционную смесь перйодатом, чтобы уничтожить гидроксилы (таким образом, дальнейшая рекомбинация была невозможна). Затем высевали смесь фрагментов на агарозу, содержащую Qβ-репликазу. Оказалось, что из нереплицирующихся фрагментов образуются реплицирующиеся молекулы, при этом число таких молекул, которое отражается в числе колоний РНК, зависело от температуры и времени предынкубации фрагментов до того, как они были окислены и смешаны с Qβ-репликазой (рис. 6). Это прямо говорило о том, что фрагменты РНК способны спонтанно реагировать в отсутствие всякого белка с образованием более крупной молекулы (Chetverina et al., 1999).
Рис. 6. Возникновение реплицируемых молекул РНК в результате спонтанной рекомбинации. Смесь фрагментов RQ РНК инкубируют в присутствии Mg2+, а затем окисляют перйодатом для уничтожения З’-гидроксилов. Это подавляет рекомбинацию в присутствии Qβ-репликазы, поэтому число колоний РНК становится зависимым от температуры и времени инкубации фрагментов до их контакта с репликазой. Скорость спонтанной рекомбинации — 10-9 ч-1 на нуклеотид.
На самом деле мы наблюдали ничто иное как эволюцию молекул РНК. Происходило образование нового качества, которое подвергалось отбору и побеждало постольку, поскольку обладало преимуществом — новым признаком: способностью к репликации.
Ваши моральные, идеалистические и вероисповедальные принципы не позволяют Вам покупать компьютерные диски? Тогда Вы просто обязаны знать, что можете совершенно безвозмездно скачать торрент файл необходимой вам программы, игры или фильма на максимальной скорости на сайте firebit.org.