РАЗМНОЖЕНИЕ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ

РАЗМНОЖЕНИЕ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ

 

Мы попытались использовать эту систему для того, чтобы размножать не малые RQ РНК, а целые гены, способные кодировать белки. Казалось бы, ген можно вставить внутрь реплицируемой молекулы и этот ген будет размножаться с остальными частями реплицируемой молекулы. Оказалось, что Qβ-репликазу нельзя обмануть: она отвергает такие искусственные рекомбинанты и способна размножать полученную РНК, только если вставка не превышает 50 нуклеотидов. Если больше, то экспоненциальный синтез прекращается: РНК становится нереплицируемой (Morozov et al., 1993).

Поэтому мы решили обратиться к другой системе экспоненциального размножения полинуклеотидов — полимеразной цепной реакции (ПЦР) (Saiki et al., 1995). Существует принципиальное отличие ПЦР от Qβ-репликазы. Qβ-репликаза размножает РНК, не используя никакого праймера или затравки, а для того, чтобы с помощью ПЦР копировать ДНК, надо дать затравку — олигодезоксирибонуклеотид, который будет отжигаться с З’-концом размножаемой последовательности. Благодаря этому, с помощью ПЦР можно размножить практически любую ДНК, используя подходящие праймеры.

Еще одним существенным отличием ПЦР от Qβ-репликазы является то, что репликация РНК Qβ-репликазой происходит при постоянной температуре в диапазоне от 20 до 40 °С, а для того, чтобы синтезировать ДНК с помощью ПЦР, необходимо периодически нагревать смесь для расплавления ДНК, потому что матрицей может работать только одноцепочечная молекула, а продуктом репликации (полимеризации) является двуцепочечная молекула. Для того, чтобы двуцепочечную молекулу разбить на одноцепочечные, необходимо ее расплавить путем нагревания.

Если мы стартуем с двуцепочечной ДНК, то ее надо расплавить, нагрев реакционную смесь до >90 °С. Если в среде присутствуют олигонуклеотидные праймеры, то при последующем понижении температуры они окажутся отожженными с З’-концевыми участками одноцепочечных молекул. Далее, если в среде присутствует ДНК-полимераза [термостабильная, способная работать при достаточно высокой температуре без инактивации (Saiki et al., 1998)], то она удлинит эти праймеры на их матрицах. Таким образом, стартуя с одной двуцепочечной молекулы ДНК, мы получим две такие же молекулы. Повторяя циклы нагревания-охлаждения, можно в экспоненциальном режиме увеличивать число молекул ДНК.

 

 

111411 2241 3 РАЗМНОЖЕНИЕ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ

Рис. 7. Выращивание и обнаружение колоний ДНК.

 

Чтобы получить с помощью ПЦР колонии ДНК, нельзя использовать агарозу, потому что агароза при нагревании выше 90 °С обязательно расплавится. Поэтому мы используем полиакриламидный гель, который полимеризуем в лунках, сделанных в предметном стекле для микроскопии (Четверина, Четверин, 2008). После формирования геля его промываем в воде, чтобы убрать все, что не заполимеризовалось и что может потом мешать в ПЦР, и высушиваем. Непосредственно перед реакцией в лунки наливаем реакционную смесь, которая содержит ДНК-полимеразу, матрицу, праймеры и нуклеотиды, из которых делается ДНК. Гель всасывает жидкость, разбухает до исходного объема, и таким образом, убирается вся свободная жидкость. Важно, чтобы свободной жидкости не было, потому что если есть свободная жидкость, то молекулы ДНК будут мигрировать и колонии не образуются. Потом осуществляем ПЦР (несколько десятков циклов нагревания-охлаждения), после чего промокаем гель нейлоновой мембраной. Если ее прогибридизовать с радиоактивным зондом, который липнет к размноженной ДНК, то там, где оказались размноженные колонии ДНК, на автографе будут видны темные пятна (рис. 7). Таким образом, можно осуществлять размножение ДНК в виде колоний (Chetverina, 2002).

Оказалось также, что можно наблюдать рост колоний ДНК и в реальном времени (Samatov, Chetverina, Chetverin, 2006). Для этого реакцию проводят в геле, который заклеен фольгой с отверстием, через которое можно наблюдать, что в геле происходит, а в гель вводят зонды, которые способны увеличивать флуоресценцию, если образуется ДНК. Например, можно использовать так называемые бинарные зонды, которые несут два флуорофора, один из которых способен поглощать возбуждающий свет и передавать энергию флуорофору другого зонда, который потом уже излучает свет. В данной ситуации, флуоресценция возможна тогда и только тогда, если эти два флуорофора сближены, а это возможно, только если образовалась ДНК, с которой эти два зонда могут гибридизоваться рядом друг с другом. Соответственно, сначала (в нулевом цикле) флуоресценция не видна, и только после того, как произошло более 30 циклов, появляются флуоресцирующие пятна, соответствующие колониям ДНК (рис. 8).

 

111411 2241 4 РАЗМНОЖЕНИЕ ГЕНОВ В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ

Рис. 8. Рост колоний ДНК в присутствии двух гибридизующихся рядом FRET-зопдов (от «Fluorescence Resonance Energy Transfers).

 

 

Таким способом можно размножать очень большие фрагменты ДНК, такие как ген обе-лина и ген зеленого флуоресцентного белка длиной примерно 800 и 1500 пар оснований соответственно. При этом образуется столько колоний, сколько посеяно молекул ДНК (Samatov, Chetverina, Chetverin, 2005).


Чистый белый свет, не раздражающий глаза, более 70 часов работы, экономичное энергопотребление – вот лишь немногие преимущества, которые Вам даст освещение светодиодными светильниками вашей частной собственности. Отвечающие всем современным стандартам светодиодные светильники за разумную цену Вы сможете найти только на сайте группы компаний «Лунный свет», который Вы сможете найти по электронному адресу lsvet.ru.


МОЛЕКУЛЯРНЫЕ КОЛОНИИ КАК АНАЛОГИ ЖИВЫХ КЛЕТОК >>


Найти на unnatural: РАЗМНОЖЕНИЕ ГЕНОВ МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ
Автор: admin | 15 Ноябрь 2011 | 292 просмотров

Новые статьи:

Оставить комментарий:

Все размещенные на сайте материалы без указания первоисточника являются авторскими. Любая перепечатка информации с данного сайта должна сопровождаться ссылкой, ведущей на www.unnatural.ru.
Rambler's Top100