«СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК

«СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК

 

Одним необычным, загадочным свойством Qβ-репликазы был, так называемый, спонтанный синтез РНК. Оказалось, что если взять очищенную Qβ-репликазу, смешать ее с чистыми нуклеотидами, не давая никакой матрицы, и проинкубировать в присутствии ионов Mg2+ при комнатной температуре, а примерно через час подвергнуть эту инкубационную смесь анализу с помощью электрофореза, то можно увидеть огромное разнообразие больших количеств РНК, которые спонтанно синтезировались — формально, без матрицы. Эти РНК обозначаются RQ (от «Rcplicable by Qp replicase», то есть реплицируемые Qβ-репликазой), а число, которое указано при RQ, отражает длину синтезируемой РНК в нуклеотидах (рис. 3). Пара сотен нуклеотидов — это примерно середина диапазона RQ РНК, длина которых варьирует от нескольких десятков до тысяч нуклеотидов (Chetverin, Spirin, 1995; Четверин, 1998).

Формально, RQ РНК синтезируются без матрицы. Это дало возможность Манфреду Айгену (Manfred Eigen) и его сотрудникам утверждать, что они наблюдают в присутствии Qβ-репликазы самозарождение информационных молекул, причем очень быстро — в течение часа. Из нуклеотидов получаются информационные молекулы, которые способны к эффективному самовоспроизведению (Sumper, Luce, 1975; Biebricher, Eigen, Luce, 1986).

Естественно возникает вопрос — какова вероятность случайного возникновения такой молекулы, которая способна реплицироваться Qβ-репликазой? Оказалось, очень небольшая. В специальных экспериментах, с помощью так называемой SELEX-процедуры, где генерируют случайные последовательности, а потом из них пытаются выбрать реплицируемые молекулы, оказалось, что рсплицируемыми худо-бедно, гораздо хуже, чем спонтанно синтезированные РНК, оказываются единичные молекулы из примерно 1012 стартового разнообразия случайных последовательностей длиной 70 нуклеотидов (Brown, Gold, 1995). Таким образом, вероятность спонтанного возникновения реплицирующихся молекул очень низка. Тем не менее, в течение часа инкубации с Qβ-репликазой получается огромное разнообразие довольно длинных молекул РНК, причем все способны к экспоненциальному размножению Qβ-репликазой.

Откуда берутся и каким образом возникают эти РНК? Мы заподозрили, что дело в загрязнении. Однако это надо было продемонстрировать, потому что Айген с сотрудниками утверждали, что они все сделали очень чисто, что они полностью очистили Qβ-репликазу, и приводили доказательные эксперименты, что их препарат Qβ-репликазы содержит менее одной молекулы матрицы. И, тем не менее, они видели синтез РНК (Sumper, Luce, 1975; Biebricher, Eigen, Luce, 1986).

 


111011 2334 4 «СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК

Рис. 3. Qβ-репликаза синтезирует разнообразные РНК в отсутствие добавленной матрицы («спонтанно»). QP-репликазу смешивают с ATP, GTP, СТР и UTP, инкубируют 1 ч при 37 0С и анализируют с помощью гель-электрофореза. РНК окрашивают в геле с помощью бромистого этидия. Стрелки указывают на мажорные RQ РНК, обнаруженные в продуктах спонтанного синтеза.

 

 

Тогда мы предположили, что мы наблюдаем нечто подобное тому, с чем Пастер имел дело в XIX в. Речь идет о самозарождении жизни в бульоне. До Пастера все говорили: «Бульон является источником жизни. Ведь если дать постоять прокипяченному бульону, то через неделю обязательно что-нибудь в нем вырастет». Что сделал Пастер? Он взял специальную колбу, у которой верхняя часть была изогнута таким образом, что ничто более тяжелое, чем воздух, в колбу не могло упасть. После того, как он прокипятил бульон в такой колбе, а затем оставил стоять, то в течение месяца там ничего не выросло (Pasteur, 1860). Таким образом, Пастером было показано, что бактерии в бульоне самопроизвольно не возникают, по крайней мере, в процессе эксперимента, что они попадают в бульон из воздуха. Там, в воздухе, летают микроорганизмы, которые попадают в бульон и дают начало росту бактерий в бульоне.

 


111011 2334 5 «СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК

Рис. 4. RQ РНК переносятся по воздуху. В две чашки Петри заливают агарозу, содержащую Qβ-репликазу и рибонуклеозидтрифосфаты. Одну чашку оставляют закрытой (слева), а другую открытой (справа). Чашки инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, затем окрашивают агарозу бромистым этидием.

 

 

Мы предположили, что у нас происходит что-то подобное. Ведь если бактерии могут летать в воздухе, то почему бы не летать молекулам РНК, которые гораздо меньше по массе» И мы сделали такой эксперимент (Chetverin, Chetverina, Munishkin, 1991). Решили провести реакцию размножения РНК не в жидкости, как все до этого делали, а в геле. Использовали легкоплавкую агарозу. Эту агарозу смешали с репликазой и нуклеотидами, в двух чашках Петри. Одну чашку оставили открытой в течение часа, а другую инкубировали закрытой. Они стояли рядом на одном и том же столе. После часа инкубации агарозу покрасили бромистым этидием. Бромистый этидий связывается прочно с высокомолекулярными полинуклеотидами, потому что он — интеркалирующий краситель. Он встраивается между плоскостями азотистых оснований. Соответственно, одиночные нуклеотиды не способны связать бромистый этидий, а полинуклеотиды способны. И когда флуоресцирующая краска оказывается в гидрофобном окружении между плоскостями оснований, то квантовый выход флуоресценции резко возрастает. Таким образом, в том месте, где синтезировалась РНК, будет повышенная флуоресценция бромистого этидия. Оказалось, что, действительно, после инкубации в течение часа в агарозе образуются флуоресцирующие пятна, и этих пятен гораздо больше в том случае, если чашка была открыта, чем когда она была закрыта. Это, как нам представляется, является прямым указанием на то, что реплицирующиеся молекулы находятся в лабораторном воздухе и «инфицируют» агарозу с Qβ-репликазой (рис. 4). Соответственно, в экспериментах Айгена и сотрудников реплицирующиеся РНК тоже инфицировали реакционные среды, вызывая как будто бы спонтанный синтез РНК, как будто бы матриценезависимый.


Вам пришлось переехать в другую страну и перед вами встал острый вопрос, как общаться с оставшимися на родине родственниками, чтобы не изводить на разговоры вся заработанные с таким трудом деньги. Я советую Вам, не ломать голову над решением этой проблемы, а skype скачать — программу, обеспечивающую бесплатную голосовую связь и сводящую к минимуму расходы на разговоры с близкими Вам людьми. Найти эту и многие другие программы Вы сможете на сайте www.infoskype.net.


ЭВОЛЮЦИЯ РНК В МОЛЕКУЛЯРНЫХ КОЛОНИЯХ >>


Найти на unnatural: «СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК
Автор: admin | 11 Ноябрь 2011 | 387 просмотров

Новые статьи:

1 комментарий
  1. Грязь из лабы Четверина доказывает только грязь в их работе. У Айгена и сотрудников были контроли на чистоту препаратов от РНК. Нехорошо лгать, господа…

Оставить комментарий:

Все размещенные на сайте материалы без указания первоисточника являются авторскими. Любая перепечатка информации с данного сайта должна сопровождаться ссылкой, ведущей на www.unnatural.ru.
Rambler's Top100