«СПОНТАННЫЙ» СИНТЕЗ РНК

Одним необычным, загадочным свойством Qβ-репликазы был, так называемый, спонтанный синтез РНК. Оказалось, что если взять очищенную Qβ-репликазу, смешать ее с чистыми нуклеотидами, не давая никакой матрицы, и проинкубировать в присутствии ионов Mg²⁺ при комнатной температуре, а примерно через час подвергнуть эту инкубационную смесь анализу с помощью электрофореза, то можно увидеть огромное разнообразие больших количеств РНК, которые спонтанно синтезировались — формально, без матрицы. Эти РНК обозначаются RQ (от «Rcplicable by Qp replicase», то есть реплицируемые Qβ-репликазой), а число, которое указано при RQ, отражает длину синтезируемой РНК в нуклеотидах (рис. 3). Пара сотен нуклеотидов — это примерно середина диапазона RQ РНК, длина которых варьирует от нескольких десятков до тысяч нуклеотидов (Chetverin, Spirin, 1995; Четверин, 1998).

Формально, RQ РНК синтезируются без матрицы. Это дало возможность Манфреду Айгену (Manfred Eigen) и его сотрудникам утверждать, что они наблюдают в присутствии Qβ-репликазы самозарождение информационных молекул, причем очень быстро — в течение часа. Из нуклеотидов получаются информационные молекулы, которые способны к эффективному самовоспроизведению (Sumper, Luce, 1975; Biebricher, Eigen, Luce, 1986).

Естественно возникает вопрос — какова вероятность случайного возникновения такой молекулы, которая способна реплицироваться Qβ-репликазой? Оказалось, очень небольшая. В специальных экспериментах, с помощью так называемой SELEX-процедуры, где генерируют случайные последовательности, а потом из них пытаются выбрать реплицируемые молекулы, оказалось, что рсплицируемыми худо-бедно, гораздо хуже, чем спонтанно синтезированные РНК, оказываются единичные молекулы из примерно 10¹² стартового разнообразия случайных последовательностей длиной 70 нуклеотидов (Brown, Gold, 1995). Таким образом, вероятность спонтанного возникновения реплицирующихся молекул очень низка. Тем не менее, в течение часа инкубации с Qβ-репликазой получается огромное разнообразие довольно длинных молекул РНК, причем все способны к экспоненциальному размножению Qβ-репликазой.

Откуда берутся и каким образом возникают эти РНК? Мы заподозрили, что дело в загрязнении. Однако это надо было продемонстрировать, потому что Айген с сотрудниками утверждали, что они все сделали очень чисто, что они полностью очистили Qβ-репликазу, и приводили доказательные эксперименты, что их препарат Qβ-репликазы содержит менее одной молекулы матрицы. И, тем не менее, они видели синтез РНК (Sumper, Luce, 1975; Biebricher, Eigen, Luce, 1986).

Рис. 3. Qβ-репликаза синтезирует разнообразные РНК в отсутствие добавленной матрицы («спонтанно»). QP-репликазу смешивают с ATP, GTP, СТР и UTP, инкубируют 1 ч при 37 ⁰С и анализируют с помощью гель-электрофореза. РНК окрашивают в геле с помощью бромистого этидия. Стрелки указывают на мажорные RQ РНК, обнаруженные в продуктах спонтанного синтеза.

Тогда мы предположили, что мы наблюдаем нечто подобное тому, с чем Пастер имел дело в XIX в. Речь идет о самозарождении жизни в бульоне. До Пастера все говорили: «Бульон является источником жизни. Ведь если дать постоять прокипяченному бульону, то через неделю обязательно что-нибудь в нем вырастет». Что сделал Пастер? Он взял специальную колбу, у которой верхняя часть была изогнута таким образом, что ничто более тяжелое, чем воздух, в колбу не могло упасть. После того, как он прокипятил бульон в такой колбе, а затем оставил стоять, то в течение месяца там ничего не выросло (Pasteur, 1860). Таким образом, Пастером было показано, что бактерии в бульоне самопроизвольно не возникают, по крайней мере, в процессе эксперимента, что они попадают в бульон из воздуха. Там, в воздухе, летают микроорганизмы, которые попадают в бульон и дают начало росту бактерий в бульоне.

Рис. 4. RQ РНК переносятся по воздуху. В две чашки Петри заливают агарозу, содержащую Qβ-репликазу и рибонуклеозидтрифосфаты. Одну чашку оставляют закрытой (слева), а другую открытой (справа). Чашки инкубируют в течение 1 часа при комнатной температуре, затем окрашивают агарозу бромистым этидием.

Мы предположили, что у нас происходит что-то подобное. Ведь если бактерии могут летать в воздухе, то почему бы не летать молекулам РНК, которые гораздо меньше по массе» И мы сделали такой эксперимент (Chetverin, Chetverina, Munishkin, 1991). Решили провести реакцию размножения РНК не в жидкости, как все до этого делали, а в геле. Использовали легкоплавкую агарозу. Эту агарозу смешали с репликазой и нуклеотидами, в двух чашках Петри. Одну чашку оставили открытой в течение часа, а другую инкубировали закрытой. Они стояли рядом на одном и том же столе. После часа инкубации агарозу покрасили бромистым этидием. Бромистый этидий связывается прочно с высокомолекулярными полинуклеотидами, потому что он — интеркалирующий краситель. Он встраивается между плоскостями азотистых оснований. Соответственно, одиночные нуклеотиды не способны связать бромистый этидий, а полинуклеотиды способны. И когда флуоресцирующая краска оказывается в гидрофобном окружении между плоскостями оснований, то квантовый выход флуоресценции резко возрастает. Таким образом, в том месте, где синтезировалась РНК, будет повышенная флуоресценция бромистого этидия. Оказалось, что, действительно, после инкубации в течение часа в агарозе образуются флуоресцирующие пятна, и этих пятен гораздо больше в том случае, если чашка была открыта, чем когда она была закрыта. Это, как нам представляется, является прямым указанием на то, что реплицирующиеся молекулы находятся в лабораторном воздухе и «инфицируют» агарозу с Qβ-репликазой (рис. 4). Соответственно, в экспериментах Айгена и сотрудников реплицирующиеся РНК тоже инфицировали реакционные среды, вызывая как будто бы спонтанный синтез РНК, как будто бы матриценезависимый.

Вам пришлось переехать в другую страну и перед вами встал острый вопрос, как общаться с оставшимися на родине родственниками, чтобы не изводить на разговоры вся заработанные с таким трудом деньги. Я советую Вам, не ломать голову над решением этой проблемы, а skype скачать — программу, обеспечивающую бесплатную голосовую связь и сводящую к минимуму расходы на разговоры с близкими Вам людьми. Найти эту и многие другие программы Вы сможете на сайте www.infoskype.net.