АКТИВНОСТЬ МИКРОБИОЛОГИЧЕСКИХ ПРОЦЕССОВ В ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ ПОДЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМАХ
Разработанные микробиологами школы СИ. Кузнецова радиоизотопные методы определения скорости микробиологических процессов нашли свое применение и при исследовании микробных сообществ термальных местообитаний, в том числе и глубинных (Pimenov, Bonch-Osmolovskaya, 2006). Последние отличаются невозможностью инкубирования изолированных проб с добавленными радиоизотопными субстратами непосредственно в месте отбора; приходится проводить инкубацию в термостате с соответствующей температурой, без учета геостатического давления, которое на глубине 1500-3000 м является значительной величиной и может существенно влиять на ход исследуемых процессов. Тем не менее, несмотря на относительный характер получаемых параметров, они способны дать нам важную информацию о некоторых процессах, протекающих в высокотемпературных глубинных местообитаниях (примером которых являются нефтяные месторождения). Так, было установлено, что в микробных сообществах пластовых вод Самотлорского нефтяного месторождения сульфатредукция и метаногенез являются конкурентными процессами и реализуются в зависимости от концентрации сульфатов (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). При этом скорости сульфатредукции, литотрофного (с использованием водорода) и ацетокластического (с использованием ацетата) метаногенеза имеют два максимума (рис. 1). Первый приходится на заводняемые скважины поверхностных горизонтов, второй (основной) — на скважины глубинных юрских горизонтов, откуда нефть изливается под естественным давлением. Можно с значительной долей уверенности предположить, что именно в этих скважинах при температуре 84 °С процессы сульфатредукции и метаногенеза осуществляет аборигенная гипертермофильная микрофлора.
Рис. 1. Скорость микробиологических процессов — сульфатредукции, литотрофного и ацетокластического метаногенеза в скважинах высокотемпературного нефтяного месторождения Самотлор, Западная Сибирь (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003, модифицировано).
Рис. 2. Влияние сульфата на скорость сульфатредукции (а) и молекулярного водорода на скорость литотрофного метаногенеза (б) в скважинах высокотемпературного нефтяного месторождения Самотлор, Западная Сибирь.
Исследование влияния на скорость процессов добавления дополнительного количества сульфатов или введения водорода в газовую фазу инкубационных флаконов показало, что присутствие сульфатов стимулирует сульфатредукцию, в то время как добавление водорода не влияет на скорость метаногенеза (рис. 2). Первое явление может быть объяснено тем, что сульфатредукторы при лимитации сульфатами могут участвовать в других процессах, например, синтрофном окислении органического вещества путем передачи электронов метаноге-нам. При добавлении дополнительного количества сульфатов эта микрофлора переключалась на их восстановление с использованием тех же доноров. Стимуляцию литотрофного метаногенеза и сульфатредукции водородом можно было бы ожидать, считая что он компенсирует потери присутствующего в пластовых водах растворенного водорода за счет дегазации при поднятии проб на поверхность и снижении давления. Однако, так как этот эффект не наблюдался, приходится предположить, что литотрофный метаногенез является не результатом использования водорода глубинного происхождения, а терминальной реакцией анаэробного разложения органического вещества, и численность присутствующих в пробе метаногенов соответствует количеству образующегося при брожении органических субстратов водорода. Таким образом, и сульфатредукция, и литотрофный метаногенез в микробных сообществах высокотемпературных нефтяных месторождений являются не первичными процессами, дающими начало микробному сообществу, существующему за счет хемосинтеза, а, наоборот, завершают анаэробную деструкцию органического вещества, видимо, захороненного в этих горизонтах в более древние геологические периоды.
ФИЛОГЕНЕТИЧЕСКИЙ АНАЛИЗ ПОДЗЕМНЫХ ТЕРМОФИЛЬНЫХ МИКРОБНЫХ СООБЩЕСТВ
Молекулярно-биологические методы, получившие развитие в последние десятилетия, дали возможность экспрессной оценки разнообразия микроорганизмов в природных местообитаниях без этапа культивирования. Кратко суть этих методов заключается в следующем: с помощью полимеразной цепной реакции гены 16S рибосомальной РНК (общепризнанный филогенетический маркер) всех микроорганизмов, присутствующих в природном образце, сначала выделяются, затем тем или иным способом разделяются и по их последовательности определяется филогенетическое положение присутствующих в пробе организмов. В случае наземных и морских гидротерм применение этих методов обнаружило присутствие в этих сообществах большого количества новых организмов, неизвестных в лабораторных культурах. Оказалось, что подземные термальные местообитания по филогенетическому составу микроорганизмов сильно различаются.
Микробные сообщества высокотемпературных нефтяных месторождений состоят в основном из представителей уже известных родов. Применение микрочипа с нанесенными на нем люминисцентными зондами, специфичными к I6S рРНК 17 родов или групп родов термофильных архей и бактерий, позволило обнаружить в пластовых водах юрского горизонта (глубина 2384 м, температура 84 °С) представителей 12 из них (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Это гипертермофильные архей рода Thermococcus, представители относящихся к глубоким филогенетическим ветвям бактерий порядков Thermotogales и Aquificales (также гипертермофилы), литотрофные метаногены родов Methanothermobacter, сульфатредуцирующие бактерии рода Desiilfolomuculimu анаэробные органотрофы рода Thermoanaerobacter и некоторые другие (рис. 2). Близкие результаты были получены путем анализа библиотек клонов генов 16S рРНК из высокотемпературных нефтяных месторождений Калифорнии (Orphan et al., 2000) и Китая (Назина и др., 2006).
Совершенно иные результаты дал филогенетический анализ термофильных микробных сообществ, развивающихся в горнодобывающих шахтах в Южной Африке (Takai et al., 2001). Путем анализа библиотек клонов генов I6S рРНК были обнаружены присутствующие там архей типа Crenarchaeota, представляющие новые филогенетические линии (рис. 3). При этом наиболее разнообразными были микробные сообщества, развивающиеся в шахтах, не оводняемых поверхностными водами метеорного происхождения. Все это дало основания предположить, что в исследуемых глубинных экосистемах развивается аборигенное сообщество, состоящее из микроорганизмов с неизвестное пока физиологией, возможно, литоавтотрофов.
В сходном местообитании близкого географического расположения (также Южная Африка, горнодобывающая шахта глубиной 2.8 км) была обнаружена еще одна микробная экосистема, также уникальная — биопленка, состоящая практически из одного микроорганизма — «Candidalus Desulj’orudis audaxiviator» (Lin et al., 2006). Роста этой бактерии в лабораторных условиях пока получить не удалось, но уже получена полная последовательность ее генома, из которой следует, что «DesulJorudis audaxiviaion> является умеренно-термофильной литоавтотрофной сульфатре-дуцирующей бактерией, использующей молекулярный водород как энергетический субстрат и углекислоту как источник углерода, причем пути фиксации углекислоты сходны с архейными.
РАЗНООБРАЗИЕ И ЧИСЛЕННОСТЬ КУЛЬТИВИРУЕМЫХ ОРГАНИЗМОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ИЗ ВЫСОКОТЕМПЕРАТУРНЫХ ПОДЗЕМНЫХ ЭКОСИСТЕМ
Параллельно с применением «прямых» методов исследования микробиологических процессов и филогенетического состава микроорганизмов в высокотемпературных глубинных экосистемах велась и работа по изучению их традиционными культуральными методами. Ряд гипертермофильных архей и бактерий, широко известных по микробным сообществам морских гидротерм, был выделен из проб в высокотемпературных нефтяных месторождениях шельфовой зоны: на Аляске (Stetter et al., 2003), в Северном море (Nielsen, Torsvik, 1996; Stetter et al., 2003), в Калифорнии (Orphan et al., 2000) и в Японии (Takahata et al., 2000). Среди них были органотрофные архей родов Thermococcits и Pyrococcus, метанобразующие и суль-фатредуцируюшие архей (роды Methanothevmococcits и Archaeoglobus), органотрофные бактерии порядка Thermotogales). Еще более удивительным было выделение этих же организмов, типичных обитателей морских гидротерм, из пластовых вод с соленостью уровня морской, но расположенных в центре континента: нефтяного резервуара Парижского бассейна (L’Haridon et al., 1995), месторождения Самотлор в Западной Сибири (Bonch-Osmolovskaya et al., 2003). Эти изоляты либо принадлежали к уже известным видам, либо представляли новые виды. Так, из проб юрских горизонтов Самотлорского месторождения был выделен новый вид гипертермофильных архей Thermococcus sibiricus (Miroshnichenko et al., 2001).
Рис. 3. Новые филогенетические группы прокариот в горнодобывающих шахтах Южной Африки (Takai et al.. 2001).
Рис.4. Клетки Thermococciis sibiricus — анаэробной органотрофной гипертермофильной архей, выделенной из нагнетательной скважины Самот.торского нефтяного месторождения, Западная Сибирь. Масштаб 0.5 мкм.
Этот организм с клетками кокковидной формы (рис. 4) растет при температуре от 40 до 95 °С, сбраживая пептиды в присутствии элементной серы, которая восстанавливается в сероводород. Можно, однако, предположить, что, как и у остальных представителей рода Thermococcus, восстановление серы у этого организма играет важную роль лишь при лабораторном культивировании в закрытых сосудах, так как позволяет избежать ингибирующего действия водорода — основного восстановленного продукта в отсутствие серы (Бонч-Осмоловская, Мирошниченко. 1994). Другие новые органотрофные термофильные прокариоты, выделенные из пластовых вод Самотлорского нефтяного месторождения, относились к порядку Thermotogales и представляли новые виды в родах Termosipho и Petrotoga (L’Haridon et al., 2002a, b).
Сходные микробные сообщества были обнаружены под океанической корой в районе глубинной гидротермальной активности (Deming, Baross, 1993; Takai, Horikoshi, 1999). Культуральные методы показали доминирование Thermococcales — органотрофных гипертермофильных архей (Takai et al., 2004). Однако при применении молекулярно-биологических методов к этому же сообществу выявилось значительное преобладание метаногенов порядка Methanococcales. Об активности последних свидетельствовал и легкий изотопный состав присутствующего метана, говорящий о его биологическом происхождении.
Численность органотрофных термофильных прокариот в высокотемпературных нефтяных месторождениях оказалась неожиданно высокой — 104-106 клеток в мл. Это подтверждает сделанное на основании радиоизотопных экспериментов предположение о том, что микробные сообщества нефтяных месторождений используют энергию захороненного органического вещества. Однако недавние данные, полученные Н.М. Шестаковой и Т.Н. Назиной (Шестакова, 2007), указывают на совершенно особую экологическую функцию, которую могут играть в природных сообществах даже представители хорошо изученных таксонов. Авторам этой работы удалось показать, что представитель органотрофного рода Thermoanaerohacler в присутствии водород-использующего метаногена способен анаэробно окислять ацетат. Таким образом, было найден агент, или, вернее, агенты ацетокластического метаногенеза, зарегистрированного в высокотемпературных нефтяных месторождениях. Полученные данные указывают также на то, как далеки от полноты наши познания о физиологии даже легко культивируемых в лабораторных условиях микроорганизмов; экстраполяция их на природные системы может не приблизить нас к пониманию истинного положения вещей.
Другим способом раскрытия экологической роли микроорганизмов, в том числе некультивируемых, является метагеномный анализ микробных сообществ и выявление функциональных генов, которые могут указать нам на метаболические пути, реализуемые в сообществе. В случае «Desulfbrudis atidaxiviatom»
такой анализ явился, по существу, определением полной геномной последовательности единственного организма, растущего, фактически, в виде чистой культуры. Несомненно, подобные работы будут проводиться и с другими, более сложными экосистемами.
ЗАКЛЮЧЕНИЕ
В заключении мы собираемся вернуться к вопросу, поставленному в заглавии этого обзора: могут ли микробные сообщества высокотемпературных подземных экосистем рассматриваться как аналоги первичных биоценозов Земли? Как мы уже увидели, эти сообщества очень сильно различаются, в первую очередь по исходному энергетическому субстрату. Микробные сообщества нефтяных месторождений, по видимости, являются органотрофными и используют органическое вещество если не самой нефти, то более доступное, захороненное вместе с окружающей породой. Это органическое вещество, скорее всего, являлось продуктом фотосинтеза. Таким образом, подземные сообщества, ассоциированные с нефтяными месторождениями, не зависят от современного фотосинтеза, но зависят от продуктов фотосинтеза, происходившего в предшествующие геологические периоды.
Что же может являться энергетическим субстратом подземных анаэробных микробных сообществ? Конечно же, в качестве основного такого субстрата рассматривается водород (Nielsen, Takai, 2005). Известно, что он может образовываться из базальта при реакции с водой и поддерживать рост водород-использующих прокариот, например метаногенов (Stevens, McKinley, 1995). Другим источником водорода является радиолиз воды — этот процесс предлагается в качестве основного для уникальной экосистемы, образуемой «Desulforudis audaxiviatoni». В последнем случае остается непонятным, почему вместе с «Desulforudis aiidaxiviator» не развивается полноценное микробное сообщество, использующее органическое вещество первичного продуцента. Возможно, какие-то ограничения накладываются особыми физико-химическими условиями, исключающими развитие всех прочих организмов, кроме «Desulforudis audaxiviatony».
Однако в случае высокотемпературных микробных сообществ основным источником водорода все-таки остаются ювенильные газы вулканического происхождения. Как уже было сказано, водород часто рассматривается как возможный источник энергии для анаэробных хемосинтетиков в гидротермах различного типа. Однако приток аллохтонного органического вещества в этих системах не позволяет считать их независимыми от современной биосферы. Возможно, наиболее близким к искомым гипотетическим сообществам будут микробные экосистемы гидротермальных местообитаний под океанической корой, где высокая численность литоавтотрофных метаногенов по сравнению с органотрофами указывает на возможность хемосинтетического происхождения первичного органического вещества в этой экосистеме.